Soutenances autorisées pour l'école doctorale [ED 497 NBISE] Normande de Biologie Intégrative, Santé, Environnement

Liste des soutenances à venir 2

Etude des altératiοns cellulaires mοléculaires,cellulaires et vasculaires induites par l'apnée du prématuré dans le cervelet de la sοuris.

Doctorant·e: RODRIGUEZ-DUBOC Agalic
Direction de thèse: BUREL DELPHINE (Directeur·trice de thèse)
Date de la soutenance: 05/06/2023 à 14:30
Lieu de la soutenance: Université de Rouen Normandie UFR Santé Batiment Stewart Amphithéatre Dumesnil(Velours) 76000 Rouen
Rapporteurs de la thèse: BOUZIER-SORE ANNE-KARINE DIRECTEUR DE RECHERCHE UNIVERSITE DE BORDEAUX
DOURNAUD PASCAL DIRECTEUR DE RECHERCHE UNIVERSITE PARIS 7 PARIS DIDEROT
Membres du jurys: BOUZIER-SORE ANNE-KARINE, DIRECTEUR DE RECHERCHE, UNIVERSITE DE BORDEAUX
BUREL DELPHINE, MAITRE DE CONFERENCES, Université de Rouen Normandie
DOURNAUD PASCAL, DIRECTEUR DE RECHERCHE, UNIVERSITE PARIS 7 PARIS DIDEROT
DUSART ISABELLE, DIRECTEUR DE RECHERCHE, UNIVERSITE PARIS 8 UNIVERSITE VINCENNES ST DENIS
TELLEY LUDOVIC, DIRECTEUR DE RECHERCHE, UNIVERSITE DE LAUSANNE (SUISSE)

Résumé: Le cervelet est impliqué dans diverses fonctions, du contrôle moteur jusqu’aux émotions. À la naissance, le cortex cérébelleux humain est encore immature, ce qui le rend vulnérable aux événements périnataux tels que l'hypoxie. L'apnée du prématuré (ADP) est l'une des principales causes d'hypoxie périnatale, puisqu'elle survient chez plus de 50 % des enfants prématurés. Or, plusieurs relations entre les fonctions cérébelleuses et les déficits observés chez les enfants ayant souffert d'ADP ont été démontrées, mais les mécanismes physio-pathologiques par lesquels l'ADP affecte le cervelet restent mal compris. Ce travail vise à mettre en lumière les mécanismes sous-jacents aux lésions hypoxiques cérébelleuses. A cette fin, nous avons développé un protocole d'hypoxie intermittente (HI), consistant en des cycles répétés de 2 minutes d'hypoxie-réoxygénation (dont 20 secondes à 5% d'O2), entre P2 et P12, 6 heures par jour, qui constitue un modèle murin valide de l'ADP. Dans un premier temps, nous montrons que le cervelet est effectivement sensible à l'HI, et présente un retard de maturation significatif à la fin de notre protocole. De plus, l'hypoxie semble induire une surexpression de gènes impliqués dans la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), qui s'accumulent dans le cervelet. A l'inverse, les gènes codant pour les enzymes antioxydantes sont sous-exprimés après l'HI, ce qui suggère une défaillance du système de défense contre les ROS. L'HI induit également des dommages à long terme, sous la forme de déficits d'apprentissage et de motricité, qui sont associés à la sur-innervation des cellules de Purkinje par les fibres grimpantes. Nous avons complété ces résultats par une étude transcriptomique des gènes impliqués dans la différenciation et la migration cellulaire. Nous avons analysé l'expression de ces gènes par RT-qPCR, à différents stades de développement et dans différents types de cellules, en utilisant la microdissection par capture laser pour séparer les couches cérébelleuses. Ceci nous a permis de déterminer que la période la plus vulnérable à l'HI est le stade P8 chez la souris, au cours duquel un nombre significatif de gènes sont dérégulés dans toutes les couches corticales cérébelleuses. De plus, il semble que les processus impliqués dans le développement du cervelet soient affectés, y compris la prolifération, la différenciation, la connectivité synaptique et la myélinisation. Plusieurs mécanismes compensatoires et neuroprotecteurs sont mis en place pendant et après l'HI, mais ils ne semblent pas suffisamment efficaces compte tenu de la persistance des déficits à l'âge adulte. Enfin, étant donné le lien établi entre l'hypoxie et la vascularisation, nous avons testé un panel de gènes axés sur ces processus et avons trouvé des régulations significatives des facteurs angiogéniques et de croissance. En outre, les résultats préliminaires d'imagerie suggèrent que le cervelet HI a un réseau vasculaire plus lâche et moins volumineux, un facteur qui pourrait participer à la physiopathologie de l'ADP. Nous avons l'intention de poursuivre cet axe de recherche avec des études immunohistochimiques et de transparisation supplémentaires. Dans l'ensemble, les données présentées ici démontrent que le cervelet est affecté par l'HI, et qu’une lésion cérébelleuse est, au moins en partie, responsable des symptômes observés chez les enfants ayant subi une ADP. Ce projet fournit des éléments pour mieux comprendre l'ADP, en reliant les altérations comportementales et histologiques à des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents plausibles. À long terme, il pourrait conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer la prise en charge clinique actuelle de cette pathologie très prévalente.
Abstract: The cerebellum is involved in diverse functions, from motor control and equilibrium to spatial learning and emotion. At birth, the human cerebellar cortex is still immature, making it vulnerable to perinatal events such as hypoxia. Apnea of prematurity (AOP) is a main cause of perinatal hypoxia, as it occurs in over 50% of preterm infants. Several relationships between cerebellar functions and the deficits observed in children having suffered from AOP have been demonstrated, but the physio-pathological mechanisms by which AoP affects the cerebellum remain poorly understood. This work aims at shedding light on the mechanisms underlying cerebellar hypoxic injury. To this end, we developed an intermittent hypoxia (IH) protocol, consisting of repeated 2-minute cycles of hypoxia-reoxygenation (including 20 seconds at 5% O2), applied between P2 and P12, 6 hours per day, which constitutes a valid murine model of AOP. In a first study, we show that the cerebellum is indeed sensitive to IH, and presents a significant delay in maturation at the end of our IH protocol. In addition, hypoxia seems to induce an overexpression of genes involved in reactive oxygen species (ROS) production, which accumulate in the cerebellum. Conversely, genes coding for antioxidant enzymes are underexpressed after IH, suggesting a failure of the defense system against ROS. IH also induces long-term damage, in the form of learning and motor deficits, which are associated with the over-innervation of Purkinje cells by climbing fibers. We followed these results with a transcriptomic study of genes involved in cell differentiation and migration. We analyzed the expression of these genes by RT-qPCR, in different developmental stages and in different cell types, using laser capture microdissection to separate cerebellar layers. This allowed us to determine that the period most vulnerable to IH is the P8 stage in mice, during which a significant number of genes are dysregulated in all cerebellar cortical layers. Moreover, it seems that all processes involved in cerebellar development are impacted, including proliferation, differentiation, synaptic connectivity, and myelination. Several compensatory and neuroprotective mechanisms are put in place during and after IH, but they do not seem to be sufficiently effective considering the persistence of deficits through adulthood. Finally, given the established connection between hypoxia and vascularization, we tested a gene panel focused on these processes and found significant regulations of angiogenic and growth factors. In addition, preliminary imaging results suggest that IH cerebella have a looser and less voluminous vascular network, a factor that could participate in the pathophysiology of AOP. We aim to pursue this line of inquiry with additional immunohistochemical and clearing studies. Overall, the data presented here demonstrate that the cerebellum is affected by IH, and that its injury is, at least in part, responsible for the symptoms observed in children having experienced AOP. This project provides elements to better understand AOP, by connecting behavioral and histological alterations to plausible underlying cellular and molecular mechanisms. In the long term, it could lead to the identification of novel therapeutic targets to improve the current clinical management of this highly prevalent pathology.

Develοpment οf high thrοughput apprοaches tο identify cancer-assοciated lοng nοncοding RΝAs

Doctorant·e: AHMAD Mohammad
Direction de thèse: MERYET-FIGUIERE MATTHIEU (Directeur·trice de thèse)
DENOYELLE Christophe (Co-directeur·trice de thèse)
MERYET-FIGUIERE MATTHIEU (Co-encadrant·e de thèse)
Date de la soutenance: 12/06/2023 à 14:00
Lieu de la soutenance: Caen
Rapporteurs de la thèse: ADRIAENSSENS ERIC Professeur des universités Université de Lille
STOJIC LOVORKA Chercheur HDR Queen Mary University of London
Membres du jurys: ADRIAENSSENS ERIC, Professeur des universités, Université de Lille
COUDERC BETTINA, Professeur des universités, Université Toulouse 3 Paul Sabatier
DENOYELLE Christophe, Maître de conférences, Université de Caen Normandie
MERYET-FIGUIERE MATTHIEU, Chercheur HDR, Université de Caen Normandie
STOJIC LOVORKA, Chercheur HDR, Queen Mary University of London
VILLEDIEU MARIE, Professeur des universités, Université de Caen Normandie

Résumé: Le cancer de l'ovaire (OC) a un taux de survie à 5 ans inférieur à 40 %, principalement en raison d'un diagnostic à des stades tardifs et d'une récidive caractérisée par une résistance à la chimiothérapie. Les lncRNAs affectent plusieurs fonctions cellulaires d'une grande importance physiologique et la perturbation de leur expression peut conduire à l'initiation et à la progression de plusieurs maladies, y compris le cancer. Dans l’OC, un certain nombre d'études indiquent que les lncRNAs jouent un rôle important dans de nombreux aspects de cette maladie. À cet égard, l'étude de l'implication des lncRNAs dans l'OC constitue une voie de recherche très prometteuse pour comprendre les mécanismes de réponse au traitement. Nous avons réalisé une analyse RNA-seq de 47 échantillons de HGSOC ; 28 avec une réponse complète à la chimiothérapie de première ligne (RC) et 19 avec une réponse partielle ou une maladie stable (RI). L'analyse des données NGS a montré 250 DEGs entre RC et RI, parmi lesquels 97 lncRNAs. Sept lncRNAs ont été sélectionnés pour étudier l'effet de leur inhibition sur un panel de lignées cellulaires de l’OC. Nous avons constaté que la régulation négative du lncRNA MYO16-AS1 à l'aide de siRNAs affecte la prolifération, la migration et l'invasion des cellules d'OC SKOV3. En outre, la surexpression de MYO16-AS1 est associée à une diminution de l'OS dans l'OC. L'analyse des données transcriptomiques et protéomiques après la modulation de MYO16-AS1 dans les cellules SKOV3 a montré que MYO16-AS1 peut réguler les gènes impliqués dans la migration cellulaire et le remodelage du cytosquelette. Parmi ces gènes, nous avons découvert que la régulation négative de MICAL2 inhibe de manière significative la migration des cellules SKOV3 en affectant leur capacité de cicatrisation. Ces résultats indiquent que MYO16-AS1 pourrait affecter la migration et l'invasion des cellules d’OC en régulant l'expression de MICAL2. En outre, nous utiliserons le screening fonctionnel basé sur CRISPR/Cas9 pour explorer le rôle possible dans la réponse au traitement des lncRNAs DE obtenus à partir de RNA-seq d'échantillons tumoraux. A cette fin, nous avons déjà établi une lignée cellulaire dérivée de SKOV3 exprimant CRISPR/Cas9 de manière inductible. De plus, nous avons conçu une librairie de pgRNA et intégré cette librairie dans un backobone lentivral approprié et emballé dans des lentivirus.
Abstract: Ovarian cancer (OC) has a 5-year survival rate of below 40% mainly due to diagnosis at late stages and recurrence characterized by resistance to chemotherapy. LncRNAs affect several cellular functions with great physiological importance and perturbation of their expression may lead to initiation and progression of several diseases including cancer. In OC, a number of studies indicated that lncRNAs play important roles in many aspects of this disease. In this regard, studying the involvement of lncRNAs in OC constitutes a highly promising research direction to understand the mechanisms of response to treatment. We performed RNA-seq of 47 HGSOC samples; 28 with complete response to 1st line chemotherapy (RC) and 19 with partial response or stable disease (RI). NGS data analysis showed 250 DEGs between RC and RI, among which 97 lncRNAs. Seven lncRNAs were selected to study the effect of their inhibition on a panel of OC cell lines. We found that the downregulation of lncRNA MYO16-AS1 in using siRNAs affects proliferation, migration and invasion of OC SKOV3 cells. In addition, the overexpression of MYO16-AS1 is associated with decreased OS in OC. Transcriptomic and proteomic data analysis after MYO16-AS1 modulation in SKOV3 cells evidenced that MYO16-AS1 may regulate genes involved in cellular migration and cytoskeleton remodeling. Among those genes we found that MICAL2 downregulation significantly inhibits SKOV3 cells migration through affecting its wound healing capacity. These findings indicate that MYO16-AS1 could affect OC cells migration and invasion through regulation of MICAL2 expression. Furthermore, we will use CRISPR/Cas9-based functional screening to explore the possible role in the response to treatment of DE lncRNAs obtained from RNA-seq of tumor samples. To that end we already established a SKOV3-derived cell line expressing CRISPR/Cas9 in an inducible way. Moreover, we designed pgRNA library and integrated this library into an appropriate lentivral backobone and packed into lentiviruses.